РАЗРАБОТКА И ПРИМЕНЕНИЕ ПЦР С ГИБРИДИЗАЦИОННО- ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ ДЕТЕКЦИЕЙ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ LEGIONELLA PNEUMOPHILA
Центральный НИИ эпидемиологии, Москва; Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов; Государственная медицинская академия, Смоленск; Центр гигиены и эпидемиологии в Свердловской области, Екатеринбург; НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи, Москва
Разработана тест-система для обнаружения ДНК L.pneumophila и L.micdadei в образцах объектов окружающей среды и клиническом материале из нижних дыхательных путей. Оценены ее аналитические характеристики при использовании тест-системы во время вспышки в г. Верхняя Пышма (Свердловская обл.) в июле 2007 г.: ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией, секвенирование фрагментов ДНК, клонирование фрагментов ДНК. Тест-система позволяет обнаруживать ДНК L.pneumophila в клиническом материале и образцах с объектов окружающей среды и определять количество ДНК бактерий в воде на основе ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией. Специфичность анализа (100%) оценивалась на панели штаммов бактерий и образцов от здоровых. Аналитическая чувствительность и предел количественного измерения - 1000 копий в 1 мл. Чувствительность анализа искусственно инфицированного биологического материала - 1000 м.к./мл. При исследовании материала со вспышки ДНК L.pneumophila была обнаружена в образцах легких умерших (4 из 4), мокроты ( 1 из 2), БАЛ ( 1 из 2) от больных с рентгенологическим подтверждением пневмонии; в образцах воды из сети теплопунктов и градирни, в смывах из душевых установок в квартирах трех заболевших. В питьевой воде и воде из фонтанов ДНК L.pneumophila не была обнаружена. Специфичность положительных результатов ПЦР доказана секвенированием ДНК. Использование тест-системы при расследовании вспышки подтвердило диагноз в случаях смертельного исхода и позволило быстро обнаружить возможный источник инфицирования.
ВВЕДЕНИЕ Среди представителей рода Legionella выделяют 50 видов широко распространенных в природе микроорганизмов, колонизирующих простейших и одноклеточные водоросли в водоемах и формирующих биопленки в ассоциации с другими микроорганизмами в водопроводном, вентиляционном и медицинском оборудовании (http://www.dsmz.de/bactnom). Из них около 20 видов способны вызывать заболевания людей, при этом 70 - 90 % случаев пневмоний, вызванных легионеллами (или болезнь легионеров), спорадического или вспышечного характера развивается вследствие ингаляции или аспирации водного аэрозоля, контаминированного L.pneumophila 1 серогруппы. Для людей со сниженным иммунитетом серьезную опасность могут представлять также L.pneumophila других серогрупп и другие представители рода. Например, в структуре заболеваемости внутрибольничными пневмониями в Финляндии болезнь легионеров обусловлена L.pneumophila 1 серогруппы только в 26 % случаев, 65 % обусловлены L. pneumophila других серогрупп и 9% легионеллами других видов.
В различных странах Европы (Испании, Италии, Турции и Франции) периодически возникают спорадические случаи и вспышки легионеллеза, преимущественно связанные с путешествиями в эти страны. С целью обнаружения, регистрации и профилактики подобных случаев, а также организации мониторинга за распространением возбудителя в объектах окружающей среды в 1986 году создана экспертная рабочая группа (EWGLI, http://www.ewgli.org), в которую вошли представители 37 стран, в том числе России.
В соответствии с действующими в настоящее время рекомендациями, разработанными EWG LI и ВОЗ, доказательством содержания легионелл в окружающей среде в количестве, достаточном для инфицирования людей, является выделение культуры бактерий с подсчетом количества микробных клеток в литре исследованного образца воды. Для лабораторного подтверждения болезни легионеров обязательным является выделение культуры из образцов респираторного тракта, легких или крови, либо обнаружение в моче фильтрующегося антигена полисахаридной природы, либо подъем в 4 раза титра специфичных антител для L. pneumophila 1 серогруппы.
Тем не менее, перечисленные методы имеют ряд ограничений для рутинного использования, что затрудняет эпидемиологический надзор. Бактериологическое исследование длительно, и его эффективность во многом зависит от качества отбора, хранения и предварительной обработки материала, а также качества используемых бактериологических сред. Кроме того, при неправильном хранении материала из окружающей среды эти микроорганизмы могут переходить в некультивируемую форму. По данным ряда авторов чувствительность выделения культуры легионелл из образцов респираторного тракта варьирует в широких пределах от 10 до 80%. Результаты иммунохроматографии и иммуноферментного анализа не позволяют зарегистрировать случаи инфицирования L.pneumophila не серогруппы 1. Серологические тесты могут быть использованы только в качестве ретроспективной диагностики и не эффективны у людей со сниженным иммунитетом.
Для оптимизации эпидемиологического надзора требуется создание эффективных методов быстрого обнаружения L.pneumophila всех серогрупп в объектах окружающей среды и в клиническом материале.
ЦНИИ эпидемиологии совместно с Российским научно- исследовательским противочумным институтом «Микроб» разработана тест-система на основе ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией, позволяющая обнаруживать ДИК L.pneumophila в образцах из нижних дыхательных путей больных и окружающей среды, а также оценивать количество легионелл в воде. В качестве мишени для обнаружения всех серогрупп L.pneumophila и L.micdadei, второго по частоте вида, имеющего эпидемическую значимость, выбран участок гена mip, который кодирует протеин 24 kDa, являющийся фактором вирулентности, необходимым для внутриклеточной инвазии, в том числе в резидентные макрофаги легких. В анализе используется экзогенный и эндогенный образцы внутреннего контроля, которые позволяют контролировать качество анализа при тестировании как клинического материала, так и объектов окружающей среды. Структура олигонуклеотидных зондов, конъюгированных с флуоресцентными красителями, позволяет проводить детекцию флуоресценции как во время ПЦР, так и после окончания реакции, что позволяет использовать в качественном формате детекции простые флуоресцентные детекторы (например, Ala-1 "Биосан", Латвия). Разработанная тест-система была апробирована на образцах клинического материала и с объектов окружающей среды.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Метод качественного выявления ДИК L.pneumophila в клиническом материале основан на одновременной амплификации (мультиплекс-ПЦР) участка ДИК гена mip L.pneumophila и участка генома человека (эндогенный внутренний контроль). Результаты амплификации ДИК L.pneumophila регистрируются при измерении флуоресценции красителя JOE, а амплификации ДИК внутреннего контроля- при измерении флуоресценции красителя FAM. Эндогенный внутренний контроль позволяет не только контролировать этапы ПЦР анализа (экстракцию ДИК и проведение ПЦР), но и оценивать адекватность забора материала, что необходимо, так как искомый возбудитель является внутриклеточным патогеном.
Метод выявления ДИК L.pneumophila в объектах окружающей среды основан на одновременной амплификации (мультиплекс-ПЦР) участка ДИК гена mip L.pneumophila и неконкурентного количественно охарактеризованного и стандартизованного экзогенного внутреннего контрольного образца (BKO-Fl), который добавляется в каждую пробирку на этапе экстракции ДИК. Результат амплификации ДИК экзогенного внутреннего контроля регистрируется по каналу FAM.
Для определения количества копий ДИК L.pneumophila и ДИК экзогенного внутреннего контрольного образца реакция проводится в формате детекции в режиме реального времени с использованием количественно охарактеризованных калибраторов, сконструированных с использованием методов клонирования ДИК в pGEM. Учет потерь ДИК экзогенного внутреннего контрольного образца позволяет рассчитать реальную концентрацию ДИК L.pneumophila в каждом исследуемом образце воды. При выполнении расчетов учитывается степень концентрации воды.
Расчет концентрации ДИК L.pneumophila (С днк Lp) в 1 л воды проводится по формуле:
Сднк Lр (копий/л)=Кднк Lр/Квко-FLxСвко-FLх2, где
Сднк Lp (копий/л) = количество копий ДИК L.pneumophila в 1 л образца воды, Кднк Lp (копий/мл) = расчетное количество копий ДИК L.pneumophila в 1 мл тестируемой пробы, Квко-FL (копий/мл) = расчетное количество копий ДНК BKO-FL в 1 мл внутреннего контрольного образца в тестируемой пробе, Свко-FL (копий/мл) = количество копий ДНК BKO-FL в 1 мл внутреннего контрольного образца (значение указано во вкладыше к тест-системе), 2 - коэффициент пересчета, учитывающий изменение объемов при фильтрации, выполненной по инструкции к тест-системе.
В работе использовался следующий материал: бактерии рода Legionella (L.pneumophila Philadelphia 1 АТСС 33152, L.pneumophila Togus АТСС 33154, L.pneumophila Вloomington АТСС 33155, L.dumoffii TexKL, L.longbeachae); 78 культур микроорганизмов из родов Bacillus, Citrobacter, Corynebacterium, Enterococcus, Escherichia, Francisella, Кlebsiella, Listeria, Proteus, Pseudomonas, Salmonella, Serratia, Shigella, Staphylococcus, Streptococcus, Yersinia; суспензия ткани легких мышей, кровь (50 образцов) и мазки со слизистых.носоглотки и ротоглотки (55 образцов), бронхоальвеолярный лаваж (1 образец), моча (30 образцов) от практически здоровых индивидов; мокрота от пациентов (16 - 87 лет), госпитализированных в клиники Смоленска с диагнозом внебольничная пневмония (200 образцов); материал от 133 человек во время вспышки легионеллеза в г. Верхняя Пышма- всего 230 образцов, в т.ч. 109 ротоглоточных смывов, 2 образца мокроты, 2 образца бронхоальвеолярного лаважа, 51 образец плазмы крови, 63 образца сыворотки крови, 8 образцов мочи; 10 образцов секционного материала (суспензии легких и селезенки) от 4 умерших пациентов; 81 проба из окружающей среды (водопроводная вода горячая и холодная, вода колодцев, фонтанов и открытых водоемов, вода техническая из градирни, смывы с внутренних поверхностей труб и душевых насадок).
Клинический материал подвергалея предварительной обработке.
Образцы промывных вод бронхов (бронхоальвеолярный лаваж) центрифугировали при 10 тыс. об/мин 10 мин. Надосадочную жидкость отбирали, и осадок ресуспендировали в 100 мкл оставшейся жидкости. Полученная суспензия (50 мкл) использовалась для экстракции ДНК.
Мокроту подвергали обработке с помощью реагента "Муколизин" производства ЦНИИЭ по инструкции к реагенту и использовали для экстракции ДНК в количестве 50 мкл.
Секционный материал гомогенизировали с использованием стерильных фарфоровых ступок и пестиков, после чего готовили 10% суспензию на стерильной фосфатно-буферной смеси. Суспензия декантировалась в течение 1 - 3 мин. Супериатаит (50 мкл) использовался для экстракции ДНК. Моча использовалась без предварительной обработки. При работе с культурами легионелл колония ресуспендировалась в 0,5 мл фосфатно-буферной смеси. Для исследования использовали 50 мкл суспензии.
Отбор и подготовка проб с объектов окружающей среды проводилась в соответствии с МУК 4.2.2217-07 "Выявление бактерий L.pneumophila в объектах окружающей среды". Вода в объеме 0,5 л предварительно фильтровалась с помощью стеклянной воронки через бумажный фильтр. Затем фильтрат пропускали через мембранный фильтр из ацетата целлюлозы с диаметром пор 0,45 мкм на установке вакуумной фильтрации «Sartorius» (Россия). После окончания фильтрации мембранный фильтр измельчался обожженными в пламени горелки ножницами (в одноразовую чашку Петри) и помещался обожженным в пламени горелки пинцетом в пробирки объемом 1,5 мл с 1 мл физиологического раствора. Пробирки инкубировались при комнатной температуре в течение 15 - 20 мин. при периодическом перемешивании на вортексе. Полученная суспензия (50 мкл) использовалась для экстракции ДНК по инструкции к тест-системе.
Смывы с объектов окружающей среды отбирали зондами с тампонами, смоченными стерильным физиологическим раствором. Рабочая часть зонда с тампоном помещалась в пробирку объемом 1,5 мл с 0,5 мл стерильного физиологического раствора, остальная часть зонда отламывалась и удалялась. Для исследования использовалось 50 мкл раствора.
Постановку реакции ПЦР осуществляли по инструкции к тест-системе «АмплиСенс Legionella pneumophila-Fl» с детекцией в режиме реального времени на приборах RotorGene 3000 или 6000 (Corbett Research, Аuстралия) или на амплификаторах "GeneAmp 2700" (Applied Biosystems, USA) с детекцией после окончания ПЦР на приборе Ala-1 (Биосан).
Секвенирование фрагментов амплификации выполняли на базе ЦНИИЭ методом «cycle sequence» с набором ABI PRISM Big Dye™ v.1.1 (Applied Biosystems, США) согласно инструкции изготовителя при использовании автоматического анализатора ABI-3100 PRISM (Applied Biosystems, США).
РЕЗУЛЬТАТЫ Оценка аналитических характеристик тест-системы проводилась на базе Российского научно-исследовательского противочумного института "Микроб". Чувствительность анализа определяли с использованием бактериальных суспензий L.pneumophila 1 - 3 серогрупп (Philadelphia 1 АТСС 33152, TogusATCC 33154, Bloomington АТСС 33155), содержащих lx102 - lx105 м.к./мл, и проб биологического материала (бронхоальвеолярный лаваж, кровь, суспензия ткани легких, моча), контаминированного легионеллами до конечной концентрации 1х102 - 1x105 м.к./мл. Чувствительность анализа при тестировании культур L.pneumophila составила 100 м.к. в 1 мл тестируемой бактериальной суспензии. При тестировании искусственно инфицированного биологического материала чувствительность анализа составила 1000 м.к. в 1 мл пробы материала. Положительный сигнал был зафиксирован только при анализе проб, содержащих L.pneumophila. Специфичность анализа составила 100%. При тестировании микроорганизмов других родов (78 штаммов) и видов рода Legionella (L.dumoffii Tex-KL, L.longbeachae), а также клинического материала от здоровых людей (136 образцов) во всех случаях отмечен отрицательный результат.
Для оценки аналитических характеристик количественного анализа проведены эксперименты по определению линейного диапазона измерения, предела детекции, предела количественного измерения с использованием количественно охарактеризованных препаратов рекомбинантных плазмид. Линейный диапазон измерения ДНК L.pneumophila определялся путем двукратного тестирования препарата рекомбинантной плазмиды в различных концентрациях (составил от 100 копий ДНК/ мл до 5х106 копий ДНК/мл, R2 = 0,99, эффективность амплификации 1,0). Аналитическая чувствительность анализа совпала с пределом количественного измерения и составила 1000 копий ДНК/мл. Линейный диапазон измерения ДНК внутреннего контрольного образца определяли путем двукратного тестирования препарата рекомбинантной плазмиды в различных концентрациях (составил от 500 копий ДНК/ МЛ до 105 КОПИЙ ДНК/мл, R2 = 1,0, эффективность амплификации 0,97).
Воспроизводимость количественного анализа оценивалась в эксперименте на образцах фильтратов воды из г. Верхняя Пышма. С этой целью троекратно тестировались 5 образцов смывов с фильтров, в которых в качественном анализе была обнаружена ДНК L.pneumophila. Результаты этого эксперимента, представленные в табл. 1, показали, что при содержании в образце ДНК L.pneumophila, начиная с 5,0x103 копий/л, образец стабильно определялся как положительный и расчетное количество ДНК варьировало с коэффициентом вариаций, не превышавшим 21%.
Таблица 1. Воспроизводимость результатов количественной ПЦР
Тест-система была апробирована на базе Государственной смоленской медицинской академии на 200 образцах мокроты от пациентов, госпитализированных в клиники г. Смоленска с сентября 2006 года по апрель 2007 года с диагнозом пневмонии, подтвержденной рентгенологически. Одновременно этот же материал был исследован с помощью стандартного бактериологического анализа. Положительный ответ в ПЦР зафиксирован в двух пробах ( 1,0 %) , тогда как выделить культуру L. pneumophila ни в одном случае не удалось. Один из положительных образцов представлял собой индуцированную мокроту. Типичная причинно-значимая бактериальная флора, вызывающая пневмонию (Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Кlebsiella pneumoniae), в данных образцах также не была обнаружена с помощью стандартного бактериологического анализа. Отсутствие других атипичных возбудителей пневмонии- Mycoplasma pneumoniae, Chlamydophila pneumoniae в этих образцах было показано с помощью ПЦР тест-системы с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени (ЦНИИЭ). Для верификации результатов ПЦР-анализа было проведено секвенирование полученных фрагментов амплификации. Установлено полное соответствие нуклеотидной последовательности ПЦР продукта фрагменту гена mip L.pneumophila, фланкированному использованными в тест-системе праймерами.
Разработанная тест-система была использована при расследовании вспышки внебольничной пневмонии в г. Верхняя Пышма в июле 2007 года. Тестированию подвергся как клинический материал (секционный материал, мокрота, сыворотка крови, моча), так и образцы из внешней среды (вода, смывы с душевых головок). Результаты анализа представлены в табл. 2, 3.
Таблица 2. Результаты тестирования образцов клинического материала
Таблица 3. Результаты тестирования образцов из окружающей среды, в которых обнаружена ДНК L.pneumophila (Верхная Пышма)
При исследовании материала со вспышки ДНК L.pneumophila обнаружена в секционном материале от 4 умерших (в 4 фрагментах легких и 1 образце селезенки), в одном из двух тестированных образцов свободно отходящей мокроты ,и в одном из двух образцов бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ). При этом положительный образец БАЛ был получен от впоследствии умершего пациента, и исследованный секционный материал также содержал ДИК L.pneumophila. Методом ПЦР в одном из 8 образцов мочи была обнаружена ДИК L.pneumophila. Образцы секционного материала от трех умерших и те же 8 образцов мочи были исследованы в лаборатории легионеллезов НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи. Из одного образца легочной ткани была выделена культура L.pneumophila 1 серогруппы, в 7 образах мочи был обнаружен фильтрующийся антиген полисахаридной природы, специфичный для L.pneumophi1a 1 серогруппы (Binax, США). С помощью ПЦР было протестировано 109 мазков из ротоглотки, из них в трех была обнаружена ДИК L.pneumophi1a. Мазки с задней стенки глотки, в которых была обнаружена ДНК возбудителя, получены на 2 - 9 день заболевания от двух пациентов с тяжелым течением заболевания и одного пациента с заболеванием средней тяжести. У одного из этих пациентов с тяжелым течением заболевания ДИК L.pneumophila была обнаружена также в сыворотке крови. В остальных 51 образцах плазмы крови и 62 образцах сыворотки крови ДНК L.pneumophila не была обнаружена. Нужно отметить, что из всех образцов крови и мазков из ротоглотки до 10 дня после начала болезни были собраны только 49 и 28 соответственно, причем в большинстве случаев клинический материал собирался уже после приема пациентами антибиотиков нового поколения с широким спектром действия.
При исследовании образцов с объектов окружающей среды, собранных эпидемиологами в различных местах города Верхняя Пышма, ДНК L.pneumophila была обнаружена в 15 из 81 проб. Секвенирование фрагментов амплификации выявило полное соответствие его нуклеотидной последовательности фрагменту гена mip L.pneumophila. Положительные образцы включали пробы технической воды из градирни и воду разводящей сети с территории завода ОАО "Уралэлектромедь"; пробы горячей воды из теплопунктов и разводящей сети. Кроме того, ДНК L.pneumophila выявлена в 3 из 22 смывов с душевых насадок, взятых в квартирах людей, проживающих в городе Верхняя Пышма и госnитализированных с диагнозом «пневмония неуточненная». В лаборатории легионеллезов НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи была выделена культура L.pneumophila 1 серогруппы из одного смыва с поверхности дренажного канала теплопункта.
ОБСУЖДЕНИЕ Для проведения ПЦР-анализа с целью обнаружения ДНК Legionella spp. предпринимаются попытки использовать ряд генов- мишеней генома микроорганизма, которые имеют свои преимущества и недостатки. Последовательности генов, кодирующих 5S и 16S рибосомальные РНК, имеют высокую гомологию у представителей различных родов и видов бактерий, родственных с Legionella spp., вследствие чего ставится под сомнение специфичность тестов, направленных на обнаружение рибосомальных генов. Например, ряд авторов сообщает о том, что попытки использовать в качестве мишени для ПЦР 5S рибосомальную РНК Legionella spp. показали невозможность избавиться от перекреста с бактериями родов Pseudomonas и Methylobacterium. Cloud J. L. et al. предложили тест на обнаружение гена, кодирующего· 5S рибосомальную РНК, Legionella spp., который, как показали дальнейшие исследования, обладал специфичностью 93%, и для подтверждения анализа необходимо было использовать последующее секвенирование фрагментов ПЦР, что позволило увеличить специфичность анализа до 98%. В последнее время для детекции бактерий рода Legionella используется ген, кодирующий 16S рибосомальную РНК, но, тем не менее, не представляется возможным создать такой тест, который бы на основе этой мишени позволял обнаруживать все встречающиеся в природе виды легионелл без потери специфичности анализа. В связи с этим, к результатам тестирования материала из респираторного тракта и крови с помощью ПЦР при использовании в качестве мишеней генов рибосомальных РНК нужно относиться с осторожностью, принимая во внимание возможность получения ложноположительных результатов вследствие сочетания высокой чувствительности и ограниченной специфичности теста с возможностью присутствия в образцах условно патогенной микрофлоры и бактерий из окружающей среды, например, при несоблюдения условий стерильности при взятии материала. Кроме того, гены 5S и 16S рибосомальных РНК находятся в геноме в нескольких копиях, причем точное их количество на 1 геном у разных видов не известно, в связи с чем их количество нельзя соотнести с количеством бактерий, и, следовательно, эти мишени не подходят для количественного анализа содержания возбудителя в воде. В качестве альтернативного подхода используется· мишень, в которой можно выбрать районы, позволяющие добиться 100% специфичности при обнаружении конкретных видов Legionella, например ген mip. Нами была разработана тест-система, в которой в качестве мишени для обнаружения всех серогрупп L.pneumophila и L.micdadei используется ген mip. Ген mip содержится в одной копии в геноме легионелл, поэтому определяемое количество копий ДНК соответствует количеству бактерий в исследуемой пробе воды. Результаты апробации подтвердили параметры тест-системы и высокую воспроизводимость количественного анализа.
Использование ПЦР-анализа позволило определить частоту внебольничных пневмоний, вызванных L.pneumophila в Смоленске, которая составила 1%. Полученные данные сопоставимы с показателем распространенности внебольничных пневмоний, вызванных L.pneumophila в Германии (3,4%), который был получен по результатам тестирования антигена в моче. ПЦР-анализ позволил подтвердить диагноз у четырех пациентов, умерших от болезни легионеров во время вспышки в г. Верхняя Пышма, и обнаружить ДНК L.pneumophila у 4 пациентов с тяжелым течением заболевания и у двух- в состоянии средней тяжести. Надо отметить, что легионеллы являются внутриклеточным патогеном, локализующимся в макрофагах легочной ткани, поэтому такой клинический материал, как мазки из верхних дыхательных путей, моча и кровь не является оптимальным для исследования. Для проведения как бактериологического, так и ПЦР исследования необходимо получение БАЛ или индуцированной мокроты, так как мокрота самостоятельно отходит у больных легионеллезной пневмонией менее чем в 50% случаев. ДНК возбудителя может быть обнаружена в мазках с задней стенки глотки, моче ,и плазме крови пациентов, но в незначительном проценте случаев. В связи с этим, исследование данного материала показано только при невозможности получения мокроты, аспирата и БАЛ, при этом отрицательный результат исследования данного материала нельзя считать окончательным. Если же ДНК L.pneumophila обнаружена в мазках с задней стенки глотки, моче и плазме крови пациентов, положительный результат можно считать окончательным, так как тест обладает специфичностью 100% и более чувствителен, чем бактериологическое исследование. Полученные данные показывают, что диагностическую чувствительность ПЦР-анализа можно увеличить, если собирать клинический материал в более ранние сроки после начала болезни (до начала терапии антибиотиками); при этом ДНК преимущественно обнаруживается в крови и моче у пациентов с более тяжелым течением болезни. У 9 пациентов в данном исследовании наблюдалось тяжелое течение заболевания, и преимущественно у этих пациентов ДНК L.pneumophila была обнаружена в моче, сыворотке или мазках с задней стенки глотки, что может свидетельствовать о связи между возможностью обнаружения ДНК возбудителя вне легочной ткани и тяжестью течения заболевания. По мнению ряда авторов, тестирование нескольких (2 - 3) образцов сыворотки от одного пациента и проведение исследования в более ранние сроки (до 10 дней) после появления симптомов позволяет увеличить чувствительность обнаружения ДНК Legionella spp. Diederen B.M.W. et al. отмечают, что при тестировании двух образцов сыворотки от каждого пациента с подтвержденной болезнью легионеров авторам удалось обнаружить ДНК Legionella spp. у 30 - 50% пациентов.
Применение ПЦР-анализа способствовало быстрому проведению эпидемиологического расследования вспышки в г. Верхняя Пышма. ДНК L.pneumophila не была обнаружена в системе снабжения города питьевой водой и в воде главного городского фонтана, что позволило быстро исключить два из предполагаемых путей передачи, в то же время, обнаружение ДИК L.pneumophila в системе горячего водоснабжения подтвердило ранее высказанную версию и позволило своевременно провести противоэпидемические мероприятия. В соответствии с действующими в настоящее время рекомендациями (EWGLI, МУК 4,2,2217-07) ПЦР может быть использована для быстрого скрипинга образцов с объектов окружающей среды, но положительный результат ПЦР при исследовании клинического материала является предварительным. Тем не менее, результаты опубликованных в настоящее время исследований позволяют оценить возможности применения современных разновидностей ПЦР-анализа в схеме эпидемиологического надзора за легионеллезом и рекомендовать использовать его более широко для количественной оценки содержания бактерий в воде. Представленные в работе результаты исследования подтвердили эффективность использования разработанной тест-системы для тестирования проб с объектов окружающей среды с целью мониторинга, выяснения источников заражения людей . L.pneumophila при проведении эпидемиологического расследования и подтверждения диагноза при исследовании материала из нижних дыхательных путей или секционного материала в случае смертельного исхода. Полученные данные позволяют предполагать, что использование разработанной тест-системы для мониторинга объектов водоснабжения, кондиционирования воздуха и медицинского оборудования позволит повысить эффективность надзора за заболеваниями, вызванными L. pneumophila.
Центральный НИИ эпидемиологии, Москва; Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов; Государственная медицинская академия, Смоленск; Центр гигиены и эпидемиологии в Свердловской области, Екатеринбург; НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи, Москва
Разработана тест-система для обнаружения ДНК L.pneumophila и L.micdadei в образцах объектов окружающей среды и клиническом материале из нижних дыхательных путей. Оценены ее аналитические характеристики при использовании тест-системы во время вспышки в г. Верхняя Пышма (Свердловская обл.) в июле 2007 г.: ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией, секвенирование фрагментов ДНК, клонирование фрагментов ДНК. Тест-система позволяет обнаруживать ДНК L.pneumophila в клиническом материале и образцах с объектов окружающей среды и определять количество ДНК бактерий в воде на основе ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией. Специфичность анализа (100%) оценивалась на панели штаммов бактерий и образцов от здоровых. Аналитическая чувствительность и предел количественного измерения - 1000 копий в 1 мл. Чувствительность анализа искусственно инфицированного биологического материала - 1000 м.к./мл. При исследовании материала со вспышки ДНК L.pneumophila была обнаружена в образцах легких умерших (4 из 4), мокроты ( 1 из 2), БАЛ ( 1 из 2) от больных с рентгенологическим подтверждением пневмонии; в образцах воды из сети теплопунктов и градирни, в смывах из душевых установок в квартирах трех заболевших. В питьевой воде и воде из фонтанов ДНК L.pneumophila не была обнаружена. Специфичность положительных результатов ПЦР доказана секвенированием ДНК. Использование тест-системы при расследовании вспышки подтвердило диагноз в случаях смертельного исхода и позволило быстро обнаружить возможный источник инфицирования.
ВВЕДЕНИЕ Среди представителей рода Legionella выделяют 50 видов широко распространенных в природе микроорганизмов, колонизирующих простейших и одноклеточные водоросли в водоемах и формирующих биопленки в ассоциации с другими микроорганизмами в водопроводном, вентиляционном и медицинском оборудовании (http://www.dsmz.de/bactnom). Из них около 20 видов способны вызывать заболевания людей, при этом 70 - 90 % случаев пневмоний, вызванных легионеллами (или болезнь легионеров), спорадического или вспышечного характера развивается вследствие ингаляции или аспирации водного аэрозоля, контаминированного L.pneumophila 1 серогруппы. Для людей со сниженным иммунитетом серьезную опасность могут представлять также L.pneumophila других серогрупп и другие представители рода. Например, в структуре заболеваемости внутрибольничными пневмониями в Финляндии болезнь легионеров обусловлена L.pneumophila 1 серогруппы только в 26 % случаев, 65 % обусловлены L. pneumophila других серогрупп и 9% легионеллами других видов.
В различных странах Европы (Испании, Италии, Турции и Франции) периодически возникают спорадические случаи и вспышки легионеллеза, преимущественно связанные с путешествиями в эти страны. С целью обнаружения, регистрации и профилактики подобных случаев, а также организации мониторинга за распространением возбудителя в объектах окружающей среды в 1986 году создана экспертная рабочая группа (EWGLI, http://www.ewgli.org), в которую вошли представители 37 стран, в том числе России.
В соответствии с действующими в настоящее время рекомендациями, разработанными EWG LI и ВОЗ, доказательством содержания легионелл в окружающей среде в количестве, достаточном для инфицирования людей, является выделение культуры бактерий с подсчетом количества микробных клеток в литре исследованного образца воды. Для лабораторного подтверждения болезни легионеров обязательным является выделение культуры из образцов респираторного тракта, легких или крови, либо обнаружение в моче фильтрующегося антигена полисахаридной природы, либо подъем в 4 раза титра специфичных антител для L. pneumophila 1 серогруппы.
Тем не менее, перечисленные методы имеют ряд ограничений для рутинного использования, что затрудняет эпидемиологический надзор. Бактериологическое исследование длительно, и его эффективность во многом зависит от качества отбора, хранения и предварительной обработки материала, а также качества используемых бактериологических сред. Кроме того, при неправильном хранении материала из окружающей среды эти микроорганизмы могут переходить в некультивируемую форму. По данным ряда авторов чувствительность выделения культуры легионелл из образцов респираторного тракта варьирует в широких пределах от 10 до 80%. Результаты иммунохроматографии и иммуноферментного анализа не позволяют зарегистрировать случаи инфицирования L.pneumophila не серогруппы 1. Серологические тесты могут быть использованы только в качестве ретроспективной диагностики и не эффективны у людей со сниженным иммунитетом.
Для оптимизации эпидемиологического надзора требуется создание эффективных методов быстрого обнаружения L.pneumophila всех серогрупп в объектах окружающей среды и в клиническом материале.
ЦНИИ эпидемиологии совместно с Российским научно- исследовательским противочумным институтом «Микроб» разработана тест-система на основе ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией, позволяющая обнаруживать ДИК L.pneumophila в образцах из нижних дыхательных путей больных и окружающей среды, а также оценивать количество легионелл в воде. В качестве мишени для обнаружения всех серогрупп L.pneumophila и L.micdadei, второго по частоте вида, имеющего эпидемическую значимость, выбран участок гена mip, который кодирует протеин 24 kDa, являющийся фактором вирулентности, необходимым для внутриклеточной инвазии, в том числе в резидентные макрофаги легких. В анализе используется экзогенный и эндогенный образцы внутреннего контроля, которые позволяют контролировать качество анализа при тестировании как клинического материала, так и объектов окружающей среды. Структура олигонуклеотидных зондов, конъюгированных с флуоресцентными красителями, позволяет проводить детекцию флуоресценции как во время ПЦР, так и после окончания реакции, что позволяет использовать в качественном формате детекции простые флуоресцентные детекторы (например, Ala-1 "Биосан", Латвия). Разработанная тест-система была апробирована на образцах клинического материала и с объектов окружающей среды.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Метод качественного выявления ДИК L.pneumophila в клиническом материале основан на одновременной амплификации (мультиплекс-ПЦР) участка ДИК гена mip L.pneumophila и участка генома человека (эндогенный внутренний контроль). Результаты амплификации ДИК L.pneumophila регистрируются при измерении флуоресценции красителя JOE, а амплификации ДИК внутреннего контроля- при измерении флуоресценции красителя FAM. Эндогенный внутренний контроль позволяет не только контролировать этапы ПЦР анализа (экстракцию ДИК и проведение ПЦР), но и оценивать адекватность забора материала, что необходимо, так как искомый возбудитель является внутриклеточным патогеном.
Метод выявления ДИК L.pneumophila в объектах окружающей среды основан на одновременной амплификации (мультиплекс-ПЦР) участка ДИК гена mip L.pneumophila и неконкурентного количественно охарактеризованного и стандартизованного экзогенного внутреннего контрольного образца (BKO-Fl), который добавляется в каждую пробирку на этапе экстракции ДИК. Результат амплификации ДИК экзогенного внутреннего контроля регистрируется по каналу FAM.
Для определения количества копий ДИК L.pneumophila и ДИК экзогенного внутреннего контрольного образца реакция проводится в формате детекции в режиме реального времени с использованием количественно охарактеризованных калибраторов, сконструированных с использованием методов клонирования ДИК в pGEM. Учет потерь ДИК экзогенного внутреннего контрольного образца позволяет рассчитать реальную концентрацию ДИК L.pneumophila в каждом исследуемом образце воды. При выполнении расчетов учитывается степень концентрации воды.
Расчет концентрации ДИК L.pneumophila (С днк Lp) в 1 л воды проводится по формуле:
Сднк Lр (копий/л)=Кднк Lр/Квко-FLxСвко-FLх2, где
Сднк Lp (копий/л) = количество копий ДИК L.pneumophila в 1 л образца воды, Кднк Lp (копий/мл) = расчетное количество копий ДИК L.pneumophila в 1 мл тестируемой пробы, Квко-FL (копий/мл) = расчетное количество копий ДНК BKO-FL в 1 мл внутреннего контрольного образца в тестируемой пробе, Свко-FL (копий/мл) = количество копий ДНК BKO-FL в 1 мл внутреннего контрольного образца (значение указано во вкладыше к тест-системе), 2 - коэффициент пересчета, учитывающий изменение объемов при фильтрации, выполненной по инструкции к тест-системе.
В работе использовался следующий материал: бактерии рода Legionella (L.pneumophila Philadelphia 1 АТСС 33152, L.pneumophila Togus АТСС 33154, L.pneumophila Вloomington АТСС 33155, L.dumoffii TexKL, L.longbeachae); 78 культур микроорганизмов из родов Bacillus, Citrobacter, Corynebacterium, Enterococcus, Escherichia, Francisella, Кlebsiella, Listeria, Proteus, Pseudomonas, Salmonella, Serratia, Shigella, Staphylococcus, Streptococcus, Yersinia; суспензия ткани легких мышей, кровь (50 образцов) и мазки со слизистых.носоглотки и ротоглотки (55 образцов), бронхоальвеолярный лаваж (1 образец), моча (30 образцов) от практически здоровых индивидов; мокрота от пациентов (16 - 87 лет), госпитализированных в клиники Смоленска с диагнозом внебольничная пневмония (200 образцов); материал от 133 человек во время вспышки легионеллеза в г. Верхняя Пышма- всего 230 образцов, в т.ч. 109 ротоглоточных смывов, 2 образца мокроты, 2 образца бронхоальвеолярного лаважа, 51 образец плазмы крови, 63 образца сыворотки крови, 8 образцов мочи; 10 образцов секционного материала (суспензии легких и селезенки) от 4 умерших пациентов; 81 проба из окружающей среды (водопроводная вода горячая и холодная, вода колодцев, фонтанов и открытых водоемов, вода техническая из градирни, смывы с внутренних поверхностей труб и душевых насадок).
Клинический материал подвергалея предварительной обработке.
Образцы промывных вод бронхов (бронхоальвеолярный лаваж) центрифугировали при 10 тыс. об/мин 10 мин. Надосадочную жидкость отбирали, и осадок ресуспендировали в 100 мкл оставшейся жидкости. Полученная суспензия (50 мкл) использовалась для экстракции ДНК.
Мокроту подвергали обработке с помощью реагента "Муколизин" производства ЦНИИЭ по инструкции к реагенту и использовали для экстракции ДНК в количестве 50 мкл.
Секционный материал гомогенизировали с использованием стерильных фарфоровых ступок и пестиков, после чего готовили 10% суспензию на стерильной фосфатно-буферной смеси. Суспензия декантировалась в течение 1 - 3 мин. Супериатаит (50 мкл) использовался для экстракции ДНК. Моча использовалась без предварительной обработки. При работе с культурами легионелл колония ресуспендировалась в 0,5 мл фосфатно-буферной смеси. Для исследования использовали 50 мкл суспензии.
Отбор и подготовка проб с объектов окружающей среды проводилась в соответствии с МУК 4.2.2217-07 "Выявление бактерий L.pneumophila в объектах окружающей среды". Вода в объеме 0,5 л предварительно фильтровалась с помощью стеклянной воронки через бумажный фильтр. Затем фильтрат пропускали через мембранный фильтр из ацетата целлюлозы с диаметром пор 0,45 мкм на установке вакуумной фильтрации «Sartorius» (Россия). После окончания фильтрации мембранный фильтр измельчался обожженными в пламени горелки ножницами (в одноразовую чашку Петри) и помещался обожженным в пламени горелки пинцетом в пробирки объемом 1,5 мл с 1 мл физиологического раствора. Пробирки инкубировались при комнатной температуре в течение 15 - 20 мин. при периодическом перемешивании на вортексе. Полученная суспензия (50 мкл) использовалась для экстракции ДНК по инструкции к тест-системе.
Смывы с объектов окружающей среды отбирали зондами с тампонами, смоченными стерильным физиологическим раствором. Рабочая часть зонда с тампоном помещалась в пробирку объемом 1,5 мл с 0,5 мл стерильного физиологического раствора, остальная часть зонда отламывалась и удалялась. Для исследования использовалось 50 мкл раствора.
Постановку реакции ПЦР осуществляли по инструкции к тест-системе «АмплиСенс Legionella pneumophila-Fl» с детекцией в режиме реального времени на приборах RotorGene 3000 или 6000 (Corbett Research, Аuстралия) или на амплификаторах "GeneAmp 2700" (Applied Biosystems, USA) с детекцией после окончания ПЦР на приборе Ala-1 (Биосан).
Секвенирование фрагментов амплификации выполняли на базе ЦНИИЭ методом «cycle sequence» с набором ABI PRISM Big Dye™ v.1.1 (Applied Biosystems, США) согласно инструкции изготовителя при использовании автоматического анализатора ABI-3100 PRISM (Applied Biosystems, США).
РЕЗУЛЬТАТЫ Оценка аналитических характеристик тест-системы проводилась на базе Российского научно-исследовательского противочумного института "Микроб". Чувствительность анализа определяли с использованием бактериальных суспензий L.pneumophila 1 - 3 серогрупп (Philadelphia 1 АТСС 33152, TogusATCC 33154, Bloomington АТСС 33155), содержащих lx102 - lx105 м.к./мл, и проб биологического материала (бронхоальвеолярный лаваж, кровь, суспензия ткани легких, моча), контаминированного легионеллами до конечной концентрации 1х102 - 1x105 м.к./мл. Чувствительность анализа при тестировании культур L.pneumophila составила 100 м.к. в 1 мл тестируемой бактериальной суспензии. При тестировании искусственно инфицированного биологического материала чувствительность анализа составила 1000 м.к. в 1 мл пробы материала. Положительный сигнал был зафиксирован только при анализе проб, содержащих L.pneumophila. Специфичность анализа составила 100%. При тестировании микроорганизмов других родов (78 штаммов) и видов рода Legionella (L.dumoffii Tex-KL, L.longbeachae), а также клинического материала от здоровых людей (136 образцов) во всех случаях отмечен отрицательный результат.
Для оценки аналитических характеристик количественного анализа проведены эксперименты по определению линейного диапазона измерения, предела детекции, предела количественного измерения с использованием количественно охарактеризованных препаратов рекомбинантных плазмид. Линейный диапазон измерения ДНК L.pneumophila определялся путем двукратного тестирования препарата рекомбинантной плазмиды в различных концентрациях (составил от 100 копий ДНК/ мл до 5х106 копий ДНК/мл, R2 = 0,99, эффективность амплификации 1,0). Аналитическая чувствительность анализа совпала с пределом количественного измерения и составила 1000 копий ДНК/мл. Линейный диапазон измерения ДНК внутреннего контрольного образца определяли путем двукратного тестирования препарата рекомбинантной плазмиды в различных концентрациях (составил от 500 копий ДНК/ МЛ до 105 КОПИЙ ДНК/мл, R2 = 1,0, эффективность амплификации 0,97).
Воспроизводимость количественного анализа оценивалась в эксперименте на образцах фильтратов воды из г. Верхняя Пышма. С этой целью троекратно тестировались 5 образцов смывов с фильтров, в которых в качественном анализе была обнаружена ДНК L.pneumophila. Результаты этого эксперимента, представленные в табл. 1, показали, что при содержании в образце ДНК L.pneumophila, начиная с 5,0x103 копий/л, образец стабильно определялся как положительный и расчетное количество ДНК варьировало с коэффициентом вариаций, не превышавшим 21%.
Таблица 1. Воспроизводимость результатов количественной ПЦР
Номер образца | Расчетная концентрация ДНК L.pneumophila (копий/л) | Среднее значение (копий/л) | Коэффициент варнаций (%) | ||
Первое исследование | Второе исследование | Третье исследование | |||
| 1 | 1951 | 553 | отрицательно | 1,3х103 | - |
| 2 | 1067 | 769 | 1106 | 9,8x102 | 19 |
| 3 | 1976 | отрицательно | 1729 | 1,9x103 | - |
| 4 | 13954 | 12985 | 9177 | 1,2x104 | 21 |
| 5 | 7486 | 5576 | 5062 | 6,0x103 | 21 |
Разработанная тест-система была использована при расследовании вспышки внебольничной пневмонии в г. Верхняя Пышма в июле 2007 года. Тестированию подвергся как клинический материал (секционный материал, мокрота, сыворотка крови, моча), так и образцы из внешней среды (вода, смывы с душевых головок). Результаты анализа представлены в табл. 2, 3.
Таблица 2. Результаты тестирования образцов клинического материала
Код больного | Тяжесть заболевания | Культура | АГ | Результаты ПЦР-анализа | |||||
| моча | сыворотка | мазок | мокрота | БАЛ | аутоптат | ||||
| БЛ | крайне тяжелое | + | нт | нт | нт | нт | нт | нт | + |
| БЧ | нт | нт | нт | нт | нт | нт | нт | + | |
| ГС | - | нт | нт | нт | нт | нт | нт | + | |
| МХ | нт | + (6) | - (6) | - (8) | нт | нт | + (8) | + | |
| ДЛ | тяжелое | нт | + | - (5) | + (7) | + (5) | нт | нт | нт |
| ДЧ | нт | + | - (9) | - (9) | + (9) | нт | нт | нт | |
| КЛ | нт | нт | нт | нт | - (6) | нт | нт | нт | |
| ЛТ | нт | + | + (9) | нт | - (9) | нт | нт | нт | |
| МН | нт | + | - (9) | - (9) | - (9) | нт | нт | нт | |
| РС | нт | + | - (10) | - (10) | нт | нт | - (12) | нт | |
| СЛ | нт | + | - (9) | - (11) | - (9) | нт | нт | нт | |
| СД | нт | нт | - (11) | - (11) | - (11) | нт | нт | нт | |
| ОЗ | средней тяжести | нт | нт | - (3) | - (3) | - (3) | + (3) | нт | нт |
| РН | нт | нт | нт | - (11) | - (11) | - (11) | нт | нт | |
| ШД | нт | нт | нт | нт | + (2) | нт | нт | нт | |
Таблица 3. Результаты тестирования образцов из окружающей среды, в которых обнаружена ДНК L.pneumophila (Верхная Пышма)
| Тип образца (адрес) | Концентрация (копий ДНК/л) |
| Вода из разводящей сети завода «Уралэлектромедь» | 1,5х103 |
| Вода из разводящей сети в дущевой казармы в/ч 74291 | 1,Зх104 |
| Вода из разводящей сети в дущевой казармы в/ч 74291 | 1,0х103 |
| Вода техническая из т/провода оборотного водоснабжения завода «Уралэлектромедь» | 1,3х104 |
| Вода техническая из чаши градирни второго цикла завода «Уралэлектромедь» | З,0х104 |
| Вода техническая оборотная в градирне завода «Уралэлектромедь» | 2,3х104 |
| Горячая вода из теплопункта (ул. Петрова) | 2,5х103 |
| Теплопункт (ул. Юбилейная, 13) | 1,2х103 |
| Горячая вода из теплопункта «Новорудничий» | 1,Зх103 |
| Горячая вода из теплопункта «Типография» | 2,4х103 |
| Горячая вода из разводящей сети (ул. Орджоникидзе) | 9,8x102 |
| Вода техническая из градирни | 1,9х103 |
| Вода из чаши градирни второго цикла оборотноrо водоснабжения завода «Уралэлектромедь» | 1,2x104 |
| Горячая вода от ЦТП «Горновский» из сети жилого дома (ул. Петрова) | 2,9x103 |
| Горячая вода от ЦТП «Центральный» из сети жилоrо дома (ул. Кривоусова) | 6,0х103 |
| Душевая насадка в квартире пациента (ул. Кривоусова) | + |
| Душевая насадка в квартире пациента (ул. Юбилейная) | + |
| Душевая насадка в квартире пациента (ул. Красноармейская) | + |
При исследовании образцов с объектов окружающей среды, собранных эпидемиологами в различных местах города Верхняя Пышма, ДНК L.pneumophila была обнаружена в 15 из 81 проб. Секвенирование фрагментов амплификации выявило полное соответствие его нуклеотидной последовательности фрагменту гена mip L.pneumophila. Положительные образцы включали пробы технической воды из градирни и воду разводящей сети с территории завода ОАО "Уралэлектромедь"; пробы горячей воды из теплопунктов и разводящей сети. Кроме того, ДНК L.pneumophila выявлена в 3 из 22 смывов с душевых насадок, взятых в квартирах людей, проживающих в городе Верхняя Пышма и госnитализированных с диагнозом «пневмония неуточненная». В лаборатории легионеллезов НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи была выделена культура L.pneumophila 1 серогруппы из одного смыва с поверхности дренажного канала теплопункта.
ОБСУЖДЕНИЕ Для проведения ПЦР-анализа с целью обнаружения ДНК Legionella spp. предпринимаются попытки использовать ряд генов- мишеней генома микроорганизма, которые имеют свои преимущества и недостатки. Последовательности генов, кодирующих 5S и 16S рибосомальные РНК, имеют высокую гомологию у представителей различных родов и видов бактерий, родственных с Legionella spp., вследствие чего ставится под сомнение специфичность тестов, направленных на обнаружение рибосомальных генов. Например, ряд авторов сообщает о том, что попытки использовать в качестве мишени для ПЦР 5S рибосомальную РНК Legionella spp. показали невозможность избавиться от перекреста с бактериями родов Pseudomonas и Methylobacterium. Cloud J. L. et al. предложили тест на обнаружение гена, кодирующего· 5S рибосомальную РНК, Legionella spp., который, как показали дальнейшие исследования, обладал специфичностью 93%, и для подтверждения анализа необходимо было использовать последующее секвенирование фрагментов ПЦР, что позволило увеличить специфичность анализа до 98%. В последнее время для детекции бактерий рода Legionella используется ген, кодирующий 16S рибосомальную РНК, но, тем не менее, не представляется возможным создать такой тест, который бы на основе этой мишени позволял обнаруживать все встречающиеся в природе виды легионелл без потери специфичности анализа. В связи с этим, к результатам тестирования материала из респираторного тракта и крови с помощью ПЦР при использовании в качестве мишеней генов рибосомальных РНК нужно относиться с осторожностью, принимая во внимание возможность получения ложноположительных результатов вследствие сочетания высокой чувствительности и ограниченной специфичности теста с возможностью присутствия в образцах условно патогенной микрофлоры и бактерий из окружающей среды, например, при несоблюдения условий стерильности при взятии материала. Кроме того, гены 5S и 16S рибосомальных РНК находятся в геноме в нескольких копиях, причем точное их количество на 1 геном у разных видов не известно, в связи с чем их количество нельзя соотнести с количеством бактерий, и, следовательно, эти мишени не подходят для количественного анализа содержания возбудителя в воде. В качестве альтернативного подхода используется· мишень, в которой можно выбрать районы, позволяющие добиться 100% специфичности при обнаружении конкретных видов Legionella, например ген mip. Нами была разработана тест-система, в которой в качестве мишени для обнаружения всех серогрупп L.pneumophila и L.micdadei используется ген mip. Ген mip содержится в одной копии в геноме легионелл, поэтому определяемое количество копий ДНК соответствует количеству бактерий в исследуемой пробе воды. Результаты апробации подтвердили параметры тест-системы и высокую воспроизводимость количественного анализа.
Использование ПЦР-анализа позволило определить частоту внебольничных пневмоний, вызванных L.pneumophila в Смоленске, которая составила 1%. Полученные данные сопоставимы с показателем распространенности внебольничных пневмоний, вызванных L.pneumophila в Германии (3,4%), который был получен по результатам тестирования антигена в моче. ПЦР-анализ позволил подтвердить диагноз у четырех пациентов, умерших от болезни легионеров во время вспышки в г. Верхняя Пышма, и обнаружить ДНК L.pneumophila у 4 пациентов с тяжелым течением заболевания и у двух- в состоянии средней тяжести. Надо отметить, что легионеллы являются внутриклеточным патогеном, локализующимся в макрофагах легочной ткани, поэтому такой клинический материал, как мазки из верхних дыхательных путей, моча и кровь не является оптимальным для исследования. Для проведения как бактериологического, так и ПЦР исследования необходимо получение БАЛ или индуцированной мокроты, так как мокрота самостоятельно отходит у больных легионеллезной пневмонией менее чем в 50% случаев. ДНК возбудителя может быть обнаружена в мазках с задней стенки глотки, моче ,и плазме крови пациентов, но в незначительном проценте случаев. В связи с этим, исследование данного материала показано только при невозможности получения мокроты, аспирата и БАЛ, при этом отрицательный результат исследования данного материала нельзя считать окончательным. Если же ДНК L.pneumophila обнаружена в мазках с задней стенки глотки, моче и плазме крови пациентов, положительный результат можно считать окончательным, так как тест обладает специфичностью 100% и более чувствителен, чем бактериологическое исследование. Полученные данные показывают, что диагностическую чувствительность ПЦР-анализа можно увеличить, если собирать клинический материал в более ранние сроки после начала болезни (до начала терапии антибиотиками); при этом ДНК преимущественно обнаруживается в крови и моче у пациентов с более тяжелым течением болезни. У 9 пациентов в данном исследовании наблюдалось тяжелое течение заболевания, и преимущественно у этих пациентов ДНК L.pneumophila была обнаружена в моче, сыворотке или мазках с задней стенки глотки, что может свидетельствовать о связи между возможностью обнаружения ДНК возбудителя вне легочной ткани и тяжестью течения заболевания. По мнению ряда авторов, тестирование нескольких (2 - 3) образцов сыворотки от одного пациента и проведение исследования в более ранние сроки (до 10 дней) после появления симптомов позволяет увеличить чувствительность обнаружения ДНК Legionella spp. Diederen B.M.W. et al. отмечают, что при тестировании двух образцов сыворотки от каждого пациента с подтвержденной болезнью легионеров авторам удалось обнаружить ДНК Legionella spp. у 30 - 50% пациентов.
Применение ПЦР-анализа способствовало быстрому проведению эпидемиологического расследования вспышки в г. Верхняя Пышма. ДНК L.pneumophila не была обнаружена в системе снабжения города питьевой водой и в воде главного городского фонтана, что позволило быстро исключить два из предполагаемых путей передачи, в то же время, обнаружение ДИК L.pneumophila в системе горячего водоснабжения подтвердило ранее высказанную версию и позволило своевременно провести противоэпидемические мероприятия. В соответствии с действующими в настоящее время рекомендациями (EWGLI, МУК 4,2,2217-07) ПЦР может быть использована для быстрого скрипинга образцов с объектов окружающей среды, но положительный результат ПЦР при исследовании клинического материала является предварительным. Тем не менее, результаты опубликованных в настоящее время исследований позволяют оценить возможности применения современных разновидностей ПЦР-анализа в схеме эпидемиологического надзора за легионеллезом и рекомендовать использовать его более широко для количественной оценки содержания бактерий в воде. Представленные в работе результаты исследования подтвердили эффективность использования разработанной тест-системы для тестирования проб с объектов окружающей среды с целью мониторинга, выяснения источников заражения людей . L.pneumophila при проведении эпидемиологического расследования и подтверждения диагноза при исследовании материала из нижних дыхательных путей или секционного материала в случае смертельного исхода. Полученные данные позволяют предполагать, что использование разработанной тест-системы для мониторинга объектов водоснабжения, кондиционирования воздуха и медицинского оборудования позволит повысить эффективность надзора за заболеваниями, вызванными L. pneumophila.
